双荧光素酶报告基因实验技术原理示意图

  利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响，常应用于miRNA靶基因验证及启动子转录活性调控等方向研究。

I. 报告基因质粒构建

1. 载体选择

萤火虫载体、海肾载体

2. 构建步骤

目的片段克隆：通过PCR扩增待研究的调控序列（如启动子、3'UTR），或合成miRNA结合位点的野生型（WT）/突变型（Mut）片段。

3. 酶切连接：用限制性内切酶切割载体和目的片段，通过T4连接酶连接，转化大肠杆菌筛选阳性克隆。

4. 测序验证：确保插入片段序列正确，无移码突变。

II. 细胞培养与转染

1. 细胞准备

细胞：293T

铺板密度：转染前一天铺板，密度达60%-80%（避免细胞过密）。

2. 转染体系

3. 质粒转染

转染试剂与质粒在无血清培养基中稀释，室温孵育15-20分钟形成复合物；逐滴加入细胞培养板，轻柔混匀，37℃培养24-48小时。

III. 细胞裂解与荧光检测

1. 细胞裂解

吸弃培养基，用PBS清洗细胞1次。

加入1×裂解液，每孔50-100 μL，室温振荡15分钟。

离心（12,000g，5分钟）取上清，置于冰上待测。

2. 荧光检测

萤火虫荧光检测：取20 μL上清，加入100 μL萤火虫底物（含荧光素），酶标仪检测发光值（记为Fluc）。

3. 海肾荧光检测：立即加入100 μL海肾底物（含腔肠素），检测发光值（记为Rluc）。

4. 数据处理：计算Fluc/Rluc比值，以对照组比值为1，分析实验组的相对活性变化。

双荧光素酶报告基因常规质粒pGL3-Basic (Promega)

转录因子与启动子结合阳性结果

  双荧光素酶报告基因实验技术服务范畴：验证转录因子与启动子区域、miRNA与UTR端或LncRNA的结合。
  技术服务优势：
  ①团队经验丰富；
  ②交付周期短，提供原始图片，保证数据真实可靠。

文献解读分享：CILP1 interacting with YBX1 promotes hypertrophic scar formation by suppressing PPARs transcription，Cell Death Dis，2024年，1区，9.6分