植物在遭受机械损伤后，不定根再生是其实现自我修复与生长延续的关键策略，而这一过程离不开植物激素的精准调控。茉莉酸作为重要的植物激素，在创伤响应中会被迅速激活，参与不定根再生调控，但它短期能启动再生程序、长期却易抑制根发育的“双刃剑”效应，暗示着存在其他信号分子与其协同。植物褪黑素虽被证实对不定根形成有显著促进作用，且在植物抗逆、生长发育等多条通路中扮演信号调控“多面手”角色，但其信号转导机制以及与茉莉酸的相互作用分子机制，长期以来是植物生物学领域的未解之谜。

今天和大家分享一篇关于植物生物学领域中，植物在伤口诱导不定根再生过程里植物褪黑素信号与茉莉酸信号整合机制研究的文章。该文章于2025年1月发表在Adv Sci杂志上，标题为“Integration of Phytomelatonin Signaling With Jasmonic Acid in Wound‐induced Adventitious Root Regeneration”。

01. 研究思路

本文围绕“植物褪黑素（phytomelatonin）与茉莉酸（JA）在伤口诱导不定根（AR）再生中的信号整合机制”展开，先通过浓度梯度实验结合Schiff试剂染色，验证外源褪黑素对不定根及根原基的浓度依赖性促进效应。接着用同源序列比对克隆 SlPMTR1/2，借原生质体瞬时表达、膜蛋白免疫印迹定位其于细胞膜，通过微量热泳动（MST）测结合能力、分子对接预测位点，再以基因编辑构建突变体验证其受体功能。随后以RNA-seq筛选共调控基因锁定SlSBRL1，用双荧光素酶报告、酵母单杂交（Y1H）验证调控关系，通过双分子荧光互补（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）等明确 SlPMTR1/2-SlGPA1-SlSBRL1 信号链。探究激素互作时，用Y1H、MST等证实SlMYC2 直接结合SlPMTR1/2启动子，结合突变体与回补实验阐明协同机制，为植物激素信号研究提供技术范式。

02. 主要研究思路

（1）膜蛋白 SlPMTR1/2 是番茄中的植物褪黑素受体

为鉴定番茄中植物褪黑素受体，研究以拟南芥AtPMTR1蛋白序列为模板，通过 BLASTP分析筛选出番茄中两个高度同源基因Solyc01g098210（SlPMTR1）和 Solyc06g069490（SlPMTR2），经系统进化分析明确其与已知褪黑素受体的亲缘关系；采用RT-qPCR检测其组织表达模式及褪黑素诱导性，显示SlPMTR1全组织表达、SlPMTR2根中高表达且均受褪黑素诱导。通过生物信息学预测SlPMTR1/2为七次跨膜蛋白，利用番茄原生质体瞬时表达SlPMTR1/2-GFP融合蛋白，结合细胞膜Marker（PIP2;1-mCherry）共定位及膜蛋白免疫印迹实验，证实二者定位于细胞膜。为验证功能，在大肠杆菌中表达纯化6×His-MBP-SlPMTR1/2-GFP融合蛋白，通过微量热泳动（MST）测定其与褪黑素的结合能力，得SlPMTR1（Kd=50.67 nM）、SlPMTR2（Kd=418.78 nM）的特异性结合数据，阴性对照无结合；辅以分子对接技术，明确 SlPMTR1与褪黑素结合位点（W34、C38、H39、N44），综合证实SlPMTR1/2是番茄的植物褪黑素受体。

（2）SlMYC2通过调节SlPMTR1/2表达

研究人员先通过突变体表型分析，发现slmyc2突变体主根切除后不定根数量显著少于野生型，证实SlMYC2参与机械损伤诱导的不定根形成；结合Du等人的ChIP-seq数据及slmyc2突变体中SlPMTR1/2表达显著下调的结果，提出SlMYC2调控SlPMTR1/2 转录的假设。通过启动子序列分析，识别出SlPMTR1/2启动子上SlMYC2的结合位点 G-box（SlPMTR1为- 1206 bp处，SlPMTR2为- 248 bp 处），随后用酵母单杂交（Y1H）实验验证SlMYC2可特异性结合该G-box；通过烟草叶片双荧光素酶报告实验，显示SlMYC2与SlPMTR1/2启动子共转化时LUC/REN比值显著高于空载体对照；在大肠杆菌中表达纯化6×His-MBP-SlMYC2-GFP融合蛋白，经微量热泳动（MST）实验测得其与含G-box的SlPMTR1/2启动子片段的Kd值分别为218.2 nM和23.4 nM，阴性对照无结合，明确SlMYC2直接结合SlPMTR1/2启动子正向调控其转录。此外，通过RT-qPCR分析主根切除后96小时内下胚轴中基因表达模式，发现SlMYC2响应损伤更快（1 h达峰），SlPMTR1/2响应滞后；进一步构建slmyc2中过表达SlPMTR1/2 的株系及三突变体slmyc2;slpmtr1-1;slpmtr2-91，结合不定根计数与根原基染色实验，证实激活褪黑素信号可部分弥补JA信号缺陷，促进不定根再生。

（3）SlSBRL1介导了创伤诱导的ARs再生中植物褪黑激素信号的放大

为探究SlSBRL1在植物褪黑素信号调控伤口诱导不定根再生中的作用，研究首先通过酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶报告（LUC/REN）实验，证实SlSBRL1可结合自身启动子并增强自身表达，实现信号放大；借助原生质体瞬时表达，明确SlSBRL1定位于细胞膜与细胞核。基于拟南芥AtPMTR1-AtGPA1信号机制，通过同源序列分析克隆番茄SlGPA1，利用原生质体共定位（与细胞膜 Marker PIP2;1-mCherry 重叠）和免疫印迹实验，确认其细胞膜定位及在总蛋白与膜蛋白中的存在，且slgpa1突变体中褪黑素无法诱导不定根，证实其信号传递功能。随后通过酵母分裂泛素系统、双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补成像（LCI）及蛋白下拉（Pull-down）实验，验证 SlGPA1与SlPMTR1/2在细胞质膜互作，并通过SlPMTR1/2的N/C端片段截短实验，明确互作依赖SlPMTR1/2的C端。为衔接SlGPA1与SlSBRL1，运用BiFC、免疫共沉淀（Co-IP）及LCI实验，证实二者在细胞核与细胞膜的互作，构建SlPMTR1/2-SlGPA1-SlSBRL1信号级联。最终整合所有技术验证结果，提出工作模型：SlPMTR1/2感知褪黑素后激活SlGPA1，SlGPA1将信号传递至SlSBRL1，SlSBRL1自我放大信号并调控细胞壁相关基因，同时JA通过SlMYC2上调SlPMTR1/2增强褪黑素信号，协同促进不定根再生。

03. 参考文献