小麦是我国种植面积最广的主粮之一，氮与磷这两种养分的高效、均衡利用，直接关系到小麦的产量、品质，以及种植过程的绿色可持续性。但现实中，小麦对硝态氮的吸收常存在“过量浪费”问题，磷肥又因易被土壤固定而“难以高效利用”—— 这不仅让种植户每亩地要多投入不少化肥成本，还会引发土壤酸化、水体富营养化等环境问题，成了农业绿色发展的“拦路虎”。

今天和大家分享一篇关于聚焦小麦中的TaTCP6 基因展开研究的文章，该文章于2025年2月发表在Nature Commun杂志上，标题为“TaTCP6 is required for efficient and balanced utilization of nitrate and phosphorus in wheat”。

01. 研究思路

本文围绕小麦中氮（N）和磷（P）的高效平衡利用机制展开研究，首先通过水培表型分析设置4种营养处理，结合生物量测定明确小麦生物量提升依赖“充足N + 充足P”的协同条件，再经根系转录组测序揭示高氮（HN）可激活大量磷饥饿响应基因、低磷（LP）会削弱N信号通路的特征；随后以N吸收关键基因TaNRT2.1的启动子为诱饵，通过酵母单杂交（Y1H）筛选出硝酸盐诱导的转录因子TaTCP6，借助qPCR、原生质体蛋白检测验证其N响应特性，进而采用转基因技术构建TaTCP6过表达（OE）、敲除（CR）等株系，结合15N吸收测定、硝酸还原酶活性检测证实其对N利用的促进作用，通过Pi含量测定、水稻同源突变体验证其对P利用的调控功能；为解析分子机制，利用酵母双杂交（Y2H）筛选到TaTCP6的互作蛋白TaPHR2（PSR 核心调控因子）与TaSPX1/4（PHR 抑制因子），经BiFC、Co-IP、Pull-down等技术证实 TaTCP6通过竞争结合TaSPX1/4释放TaPHR2且增强其转录活性，形成“TCP6-SPX-PHR2”调控模块；最终通过CUT&Tag测序鉴定TaTCP6的基因组结合位点，并经两地田间试验证实中等过表达TaTCP6可显著提升产量，全程以多维度技术串联解析 TaTCP6介导N-P协同利用的机制与价值，为“低肥高效”的可持续农业提供了基因资源与理论依据。

02. 主要研究内容

（1）硝酸盐可激活氮、磷利用相关基因，以实现氮磷的协同利用。

研究通过酵母单杂交（Y1H）筛选鉴定出TaTCP6等TCP家族转录因子，经表达谱分析确认其与TaNRT2.1表达模式一致，Y1H和EMSA证实二者启动子直接结合。通过qPCR检测到TaTCP6转录受硝酸盐诱导（4-6h 达峰），水稻同源基因亦如此；小麦原生质体实验显示高氮下其蛋白丰度升高，亚细胞定位明确其定位于细胞核。以TaTCP6 为诱饵的Y2H筛选发现NLP家族互作蛋白，LCI实验验证其与TaNLP4的相互作用。构建TaTCP6过表达、敲除及SRDX抑制转基因株系，结合水稻突变体，表型分析显示其功能依赖氮水平；蛋白检测揭示硝酸盐经翻译后修饰增强其稳定性。qPCR、硝酸盐吸收测定、瞬时荧光素酶实验及EMSA证实其正向调控氮代谢基因。15N标记、NR 活性及养分含量检测明确其对氮积累的作用，还可能参与氮分配。对TaTCP19，经同源分析、表达检测及荧光素酶抑制实验，发现其与TaTCP6呈拮抗作用，最终证实 TaTCP6响应硝酸盐正向调控氮吸收利用。

（2）TaTCP6在小麦磷的吸收与利用中发挥关键作用

基于OsTCP19过表达水稻中OsPht1;2表达受抑的前期结果及TaTCP6转基因小麦籽粒磷含量变化提出功能假设后，通过基因表达检测技术发现TaTCP6过表达株系中 TaPAP10c-5A、TaPHF-5A等磷利用相关基因表达增强，借助Pi含量测定技术证实其无机磷积累升高；利用水稻基因敲除技术获得Ostcp6突变体，发现其磷吸收速率降低，实现同源功能验证。为解析机制，以TaTCP6为诱饵开展酵母双杂交（Y2H）文库筛选，鉴定出磷饥饿响应关键因子TaPHR2等GARP家族转录因子；通过截短体蛋白互作实验明确TaTCP6结合此类因子的MYB结构域，再经双分子荧光互补（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down及荧光素酶互补成像（LCI） 等技术，验证TaTCP6与 TaRLI1、TaPHR2在细胞核内的相互作用。

(3) TaTCP6通过与TaSPXs家族蛋白竞争结合，阻断TaPHR2与TaSPXs的相互作用

鉴于含SPX结构域蛋白在抑制磷饥饿响应（PSR）中的作用及经酵母双杂交（Y2H）筛选的鉴定结果，先通过系统发育分析从麦类、水稻、拟南芥中分离 TaSPX1/3/4/6，经蛋白稳定性检测发现除TaSPX1外其余TaSPXs稳定性与硝酸盐呈负相关，通过同源互作验证确认SPX-RLI1作用在麦稻中保守。利用亚细胞定位分析明确 TaSPX1定核、TaSPX4定质膜、其余呈核质分布后，以双分子荧光互补（BiFC） 初步证实TaTCP6与所有TaSPX互作且主要发生在细胞核，再经免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down、荧光素酶互补成像（LCI）验证其与TaSPX1/4的关键互作，并通过体外 Pull-down实验发现该互作不依赖磷（区别于已知的OsSPXs-OsPHR2磷依赖性互作）。为验证竞争机制，采用小麦原生质体瞬时表达实验观察到TaTCP6可解除 TaSPX4对TaPHR2的胞质滞留、促进其入核，通过本氏烟荧光信号梯度检测显示 TaTCP6用量增加会削弱TaPHR2-TaSPX1互作信号，借助Co-IP实验证实TaTCP6或 TaPHR2均可减弱TaSPX1与另一者的结合。最后以原位杂交技术发现 TaTCP6/TaTCP19/TaPHR2/TaSPX1在小麦根中表达模式相似，通过LCI实验验证 TaTCP19与TaPHR2强互作但与TaSPX1/4弱互作或无互作。

03. 参考文献