在全球气候变化背景下，高温高湿（HTHH）已成为制约农业生产的关键复合胁迫因子，它既会直接引发植物热损伤，又会削弱免疫系统增加病原菌侵染风险，而植物如何在这种贴近田间实际的胁迫下协调 “耐热” 与 “免疫” 两大核心反应，其分子机制长期未明。今天和大家分享一篇关于聚焦辣椒抗逆机制研究的文章，该文章于2023年7月发表在nature communications杂志上，标题为“Differential CaKAN3-CaHSF8 associations underlie distinct immune and heat responses under high temperature and high humidity conditions”。

01. 研究思路

该研究针对高温高湿（HTHH）下茄科作物“耐热 - 免疫”协调机制空白的问题展开：先从辣椒“HTHH +青枯菌”处理的RNA-seq数据中，筛选出仅在HTHH相关条件下上调、定位于细胞核的CaKAN3（原涉发育）与CaHSF8（原涉耐热）。通过VIGS沉默与烟草过表达实验，证实二者均为HTHH下抗青枯菌免疫的正调控因子，仅 CaHSF8参与极端高温耐热。再用IP-MS、BiFC、MST、CoIP 等技术解析互作机制，证实两者在HTHH早期（1-3h）或中温（31-37℃）下于细胞核内依赖CaHSF8的 HR-A/B结构域与CaKAN3全长互作，HTHH后期（6h）或极端高温（45℃）下互作消失，且免疫调控需二者协同、耐热中CaHSF8可独立作用。经ChIP-seq及验证，二者共激活6个含特定基序的NLR免疫靶基因，CaHSF8单独激活4个HSP耐热靶基因。最终构建模型：HTHH早期有病原菌时，二者互作激活 NLR启动免疫；后期无病原菌或极端高温时，互作解离，CaHSF8单独激活HSP启动耐热，首次揭示转录因子“差异结合”介导的抗逆调控机制。

02. 主要研究内容

（1）CaKAN3 与 CaHSF8 相互作用

为筛选潜在调控蛋白，我们以“经28℃、90%湿度或37℃、90%湿度条件下青枯菌（RSI）处理的CaKAN3-GFP瞬时过表达辣椒叶片”为材料，提取CaKAN3-GFP蛋白进行IP-MS分析；结果显示，在37℃、90%湿度+RSI条件下，共获得10个高置信度的CaKAN3潜在互作蛋白。经 BiFC 实验初步验证筛选出CaHSF8，后续通过MST实验、Pull-down 实验及CoIP实验进一步验证。所有数据证实CaKAN3与CaHSF8存在互作，且BiFC实验显示二者互作发生于细胞核内。通过构建3 个CaHSF8缺失突变体与 1 个CaKAN3缺失突变体，结合Pull-down实验分析互作必需结构域，结果显示 CaHSF8缺失突变体D3与CaKAN3均不互作，CaKAN3缺失突变体CaKAN3myb与 CaHSF8也不互作，表明CaHSF8的HR-A/B结构域及CaKAN3全长是二者互作的必需条件。

（2）用ChIP测序法测定CaKAN3和CaHSF8的DNA结合位点

为探究作用模式，我们以“37℃、90%湿度+青枯菌（RSI）处理的CaKAN3或CaHSF8 过表达辣椒叶片”为材料提取染色质，通过ChIP-seq确定二者DNA结合位点：CaKAN3有10661个高置信度结合位点（关联717个基因），CaHSF8有36473个（关联2337个基因，p<0.05）；二者超89%结合峰位于远端基因间区，仅7-8%在靶基因启动子区。比较发现199个重叠结合峰，富集于植物-病原菌互作等通路。利用 DREME/MEME软件，鉴定出CaKAN3保守结合序列AACAA、CaHSF8保守结合序列 TTCTAGAA；EMSA实验显示，CaKAN3-GST可结合3×AACAA，突变序列3×AAAAA 无结合，且3×AACAA驱动的GUS活性在37℃、90%湿度下因CaKAN3-HA过表达增强，28℃、90%湿度下减弱。同理，CaHSF8可结合TTCTAGAA，其过表达在两种温湿度下均增强3×HSE驱动的GUS活性，表明二者分别通过AACAA、HSE调控靶基因。酵母单杂交实验显示，CaHSF8（及阳性对照CabZIP6369）有转录活性，CaKAN3无转录活性。

（3）CaHSF8 以温度依赖性方式与 CaKAN3 发生差异结合，从而协同激活高湿高温（HTHH）特异性免疫反应与耐热性

通过BiFC、Nluc/Cluc 实验发现：二者在28℃、34℃、37℃处理1h及37℃处理1-3h互作，37℃6h及45℃各时间点均无互作，MST、CoIP验证与之一致，证实HTHH早期二者特异性互作。与28℃、90%湿度（RTHH）相比，45℃或37℃3h后CaHSF8对6个NLR基因的激活受抑，而4个HSP基因在45℃或37℃长期处理下上调，且CaHSF8过表达在HTHH/RSHT下1-6h均上调HSP基因。此外，CaHSF8在28℃、37℃可结合NLR启动子，45℃不可，却在37℃6h及45℃各时间点结合HSP启动子；CaKAN3在三种温湿度下均结合NLR启动子，结合亲和力无显著时间差异。以上表明，CaHSF8通过温度依赖性差异结合CaKAN3，分别激活高温特异性免疫与耐热性。

03. 参考文献

Yang S, Cai W, Wu R, et al. Differential CaKAN3-CaHSF8 associations underlie distinct immune and heat responses under high temperature and high humidity conditions. nature communications. 2023 Jul 25;14:4477. doi: 10.1038/s41467-023-40251-8