瞄准P-选择素/PSGL1轴！硫福罗汀为肝内胆管癌精准治疗开辟新路径

在肿瘤研究领域，肿瘤 - 再增殖细胞（TRCs）是导致癌症复发转移的“顽固分子”。肝内胆管癌（ICC）作为难治性肝癌，因手术切除率低、放化疗不敏感，患者预后极差，而ICC-TRCs更是加剧了治疗困境，常规化疗药物对其抑制效果有限。

今天和大家分享一篇关于聚焦新型合成视黄酸类药物硫福罗汀对ICC-TRCs的精准抑制作用的文章，该文章于2024年11月发表在Advanced Science杂志上，标题为“Synthetic Retinoid Sulfarotene Selectively Inhibits Tumor‐Repopulating Cells of Intrahepatic Cholangiocarcinoma via Disrupting Cytoskeleton by P‐Selectin/PSGL1 N‐Glycosylation Blockage”。

01研究思路

该研究针对肝内胆管癌（ICC）中肿瘤 - 再增殖细胞（ICC-TRCs）导致治疗困境的问题，以新型合成视黄酸类药物硫福罗汀为研究对象，通过多种技术展开系统探究。首先利用 CCK8 assay、Transwell 实验及免疫荧光技术，在体外验证硫福罗汀对ICC-TRCs增殖、迁移、侵袭的抑制作用及特异性，并结合动物模型（裸鼠异种移植瘤模型）通过IHC技术证实其体内抑瘤效果；接着借助RNA-seq、qRT-PCR 和IB技术分析基因表达变化，结合MST和分子对接技术明确硫福罗汀与RARα的直接结合及核 translocation作用，再通过ChIP-PCR和双荧光素酶报告基因技术证实RARα对SELP的转录抑制，揭示其下调P - 选择素的机制；同时运用Lip-SMap技术筛选潜在靶点，结合MST和突变体实验确定硫福罗汀与FUT8的相互作用，通过CoIP、LCA印迹及G/F-actin分离实验，阐明其抑制PSGL1核心岩藻糖基化的作用；最终通过siRNA干扰、过表达实验及药物干预实验等技术手段，多维度验证硫福罗汀通过破坏P - 选择素 / PSGL1轴调控的细胞骨架，实现对ICC-TRCs的选择性抑制。

02主要研究内容

（1）硫福罗汀（Sulfarotene）调控视黄酸受体 α（RARα）的细胞定位而非表达量

通过RNA 测序、qRT-PCR 和免疫印迹（IB） 证实，SFT对ICC-TRCs及二维细胞中RARα、RARβ、RARγ的表达量无显著影响，与肝癌模型中促进RARα表达的机制不同；借助细胞定位分析和免疫荧光（IF）发现，SFT可显著提高HUCCT1-TRCs和RBE-TRCs的核内RARα水平，且ICC-TRCs与二维细胞的核心差异在于核内RARα水平降低而非总表达量变化；功能实验中，结合siRNA 沉默技术敲低 RARα，或用其拮抗剂BMS195614预处理，均逆转了SFT对ICC-TRCs集落生长、迁移和侵袭的抑制效应，证实RARα是关键靶点；最终通过微量热泳动（MST） 测得SFT与重组RARα的解离常数为 1.06×10⁻⁶，并经分子对接技术揭示两者通过氢键（GLN352）和 π-π 相互作用（PHE26 等残基）稳定结合（结合能 - 7.6 kcal/mol），明确RARα是SFT的直接作用靶点。

（2）硫福罗汀（Sulfarotene）通过调控视黄酸受体α（RARα）抑制 P - 选择素的转录

研究人员利用RNA-seq结合R语言EdgeR包进行差异基因分析，以 | log2 (倍数变化)|>1 且 p<0.05 为阈值，在HUCCT1-TRCs中筛选出597个SFT处理相关差异表达基因（DEGs）；通过pheatmap包将这些 DEGs聚类为8种表达模式，发现第4、5、7组基因表达随SFT浓度升高下降，进一步经KEGG富集分析显示其功能涉及细胞因子 - 受体互作、趋化因子信号等癌症相关通路。借助蛋白 - 蛋白相互作用（PPI）分析和 MCODE 算法挖掘核心模块，结合Cytoscape 的中心性分析（基于介数、度及紧密中心性），锁定SELP（P - 选择素编码基因）为关键靶基因。为验证SELP与RARα的调控关系，通过JASPAR 数据库预测到SELP启动子区的RARα结合元件（-1398 至 - 1415 bp 和 + 1258 至 + 1274 bp）；利用HDOCK Server模拟对接证实RARα DNA结合域关键氨基酸（ARG83、TYR100 等）与这些元件的功能性结合；双荧光素酶报告基因实验显示，RARα过表达或SFT处理可降低野生型SELP启动子驱动的荧光素酶活性，而元件突变可逆转该效应；最终通过染色质免疫沉淀 PCR（ChIP-PCR） 直接证实RARα与SELP基因的结合能力。综上，系列技术联用明确SELP是SFT靶向的RARα的直接转录靶基因。

（3）FUT8是ICC-TRCs中SFT的直接靶点

从糖基因数据库（GGDB） 筛选糖基转移酶 / 糖苷酶基因并排除MGAT3后，采用限制性蛋白水解质谱（Lip-SMap） 结合质谱（MS）及Maxquant无标记定量（LFQ），筛选出10个潜在靶点；经差异表达分析和生存分析锁定FUT8（其在 ICC 组织上调且与预后相关）。通过RNA-seq和qRT-PCR证实SFT不影响FUT8表达，构建FUT8突变体后，微量热泳动（MST） 显示SFT与野生型FUT8结合更强（Kd=9.83×10⁻⁸），分子对接验证其通过氢键和疏水作用结合。功能上，sgRNA 敲除技术显示FUT8缺失抑制ICC-TRCs恶性表型；回补实验结合Western blot、F-actin 荧光检测等证实，SFT仅在野生型FUT8细胞中有效抑制PSGL1糖基化及恶性表型，明确抑制FUT8活性是SFT的另一关键机制。

03参考文献

Du X, Qi Z, Chen S, et al. Synthetic Retinoid Sulfarotene Selectively Inhibits Tumor‐Repopulating Cells of Intrahepatic Cholangiocarcinoma via Disrupting Cytoskeleton by P‐Selectin/PSGL1 N‐Glycosylation Blockage. Advanced Science. 2024, 12(3):2407519. doi:10.1002/advs.202407519