生物育种新靶点！番茄通过woolly/SlMYC1-JA通路增强抗虫性的分子机制

番茄在田间易受蚜虫、红蜘蛛等害虫侵扰，传统农药防治存在污染环境、诱发抗药性等问题，挖掘其自身抗虫机制对培育优良品种至关重要。植物腺毛是重要防御屏障，番茄腺毛既能通过物理阻隔抵御害虫，又能合成释放萜类等化学防御物质，而茉莉酸（JA）作为关键抗虫信号分子，其调控腺毛发育与防御物质合成的具体机制尚不明确。

今天和大家分享一篇关于番茄中茉莉酸（JA）信号传导的调控机制及其对害虫抗性研究的文章，该文章于2020年9月发表在Plant Biotechnol J杂志上，标题“Mediation of JA signalling in glandular trichomes by the woolly/SlMYC1 regulatory module improves pest resistance in tomato”。

01研究思路

本研究以番茄为研究对象，围绕woolly（wo）/SlMYC1调控模块介导茉莉酸（JA）信号调控腺毛发育及萜类合成的机制展开，技术手段为研究提供关键支撑。首先通过正向遗传学筛选获得wo功能缺失突变体（woW106R），结合BSA-Seq定位突变位点，并利用CRISPR-Cas9构建wo和SlMYC1敲除株系，验证基因功能；采用扫描电镜和共聚焦显微镜观察腺毛形态与数量差异，明确基因对腺毛发育的影响。其次，通过RNA-Seq筛选wo突变体中差异表达的萜类合酶（TPS）基因，借助qRT-PCR验证其表达模式；利用酵母单杂交和生物素IP实验证实wo与TPS启动子的直接结合，通过酵母双杂交、双分子荧光互补、荧光素酶互补成像及pull-down实验，揭示wo与SlMYC1、JAZ2的蛋白相互作用及JAZ2的竞争性抑制作用。最后，通过双荧光素酶报告基因分析转录调控关系，结合GC-MS检测萜类含量，经双选择实验评估抗虫性，最终阐明wo/SlMYC1模块介导JA信号提升番茄抗虫性的分子机制。

02主要研究内容

（1）Woolly与JA信号通路互作调控毛状体发育及萜烯生物合成

通过气相色谱 - 质谱联用（GC-MS） 定量分析发现，woW106R突变体及CR-wo植株的单萜、倍半萜含量显著低于野生型；结合转录组测序（RNA-seq） 筛选出毛状体高表达且在突变体中下调的TPS1、TPS5、TPS12等萜烯合成关键基因，经实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证其在突变体及毛状体腺细胞中均低表达。为明确调控方式，采用酵母单杂交（Y1H）及生物素免疫沉淀（biotin-IP） 实验，证实Wo蛋白可直接结合TPS基因启动子的L1框基序，而W106R突变会破坏该结合。通过MeJA处理实验结合表型统计与qRT-PCR，发现Wo是JA诱导VI型毛状体发育及 TPS基因表达的必需因子，且RNA-seq显示二者调控基因高度重叠。利用酵母双杂交（Y2H） 、双分子荧光互补（BiFC） 、荧光素酶互补成像（LCI） 及蛋白 pull-down 技术，进一步鉴定出Wo通过ZIP-START结构域与JA信号抑制因子JAZ2特异性互作，最终阐明二者协同调控的分子通路。

（2）Woolly 与 SlMYC1 在番茄毛状体中形成调控模块

通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）证实SlMYC1在番茄VI型毛状体中高表达，并利用启动子- GUS融合载体转化技术，明确其在VI型、VII型毛状体中高表达且在其他组织中广泛低表达的时空模式。为探究SlMYC1与Wo的关系，采用酵母双杂交（Y2H）实验发现二者存在互作，且SlMYC1可结合Wo的所有四个结构域，Wo的 W106R突变不影响该互作；随后通过双分子荧光互补（BiFC） 、荧光素酶互补成像（LCI）及体外pull-down 技术进一步验证该互作。为解析其功能，借助CRISPR-Cas9 基因编辑技术构建SlMYC1敲除株系（CR-SlMYC1），结合扫描电镜（SEM）观察与表型定量分析，发现其VI型毛状体密度显著降低、类VII型毛状体增多，而长毛状体及小型腺毛总数无明显变化；最后通过气相色谱 - 质谱联用（GC-MS）证实CR-SlMYC1植株中萜烯含量显著下降，从而揭示Wo与SlMYC1在番茄毛状体中形成调控模块的机制。

(3) JAZ蛋白可破坏SlMYC1与Wo的互作

通过酵母双杂交（Y2H）筛选发现SlMYC1可与番茄JAZ2、JAZ4等5种JAZ蛋白互作，随后借助双分子荧光互补（BiFC） 、荧光素酶互补成像（LCI） 及pull-down 技术，进一步验证JAZ2与SlMYC1的物理结合。为探究JAZ2对SlMYC1-Wo互作的影响，利用酵母三杂交（Y3H）实验观察到Wo表达可减弱SlMYC1-JAZ2互作，结合竞争性pull-down 与LCI实验，证实JAZ2能破坏二者互作，进而揭示JA存在与否下的调控机制。在抗虫性研究中，通过二选一取食偏好实验发现叶螨更倾向选择 Wo/SlMYC1功能缺失突变体叶片，而偏好避开SlMYC1过表达株系；同时采用CRISPR-Cas9技术构建敲除株系、通过载体转化获得过表达株系，结合扫描电镜观察 、毛状体定量分析及气相色谱-质谱联用（GC-MS） ，明确SlMYC1过表达不改变毛状体数量但显著提升萜烯含量，最终通过叶螨取食危害定量实验证实该模块通过调控萜烯合成增强抗虫性。

03参考文献

Hua B, Chang J, Wu M, et al. Mediation of JA signalling in glandular trichomes by the woolly/SlMYC1 regulatory module improves pest resistance in tomato. Plant Biotechnol J. 2020, 19(2):375–393. doi: 10.1111/pbi.13473